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9月16日中午，伏击巴拉圭陆军第一师所部的巴西共和国军队抵达亚松森前线，而且与他们一同返回亚松森的还有近3000人的巴拉圭陆军第一师所部的俘虏。
当被俘虏的士兵出现在城墙之外的空地上，亚松森城内的巴拉圭守军瞬间慌了神。
巴拉圭陆军第一师是除了汉国军队外，最具备战斗力也是最后一支隶属于巴拉圭高层们指挥的正规部队，而现下，汉国援军尚未抵达，被他们寄予厚望的巴拉圭陆军第一师又被巴西共和国方面“消灭”，听闻这样的噩耗时，可想而知会对守军一方造成多么大的打击。
9月16日傍晚七时十分，巴西共和国军队一反常态得选择在夜间，对亚松森城发动进攻。
傍晚八时三十分，巴西共和国军队陆续加强一线进攻兵力，直接用于进攻亚松森城防工事的士兵数量，超过了2万人。
傍晚八时五十九分，亚松森城外最后一处高地防线失守，驻守高地防线的巴拉圭士兵除去70余人战死，剩下近500名士兵全部选择以向进攻部队投降的方式，结束战斗。
傍晚十时四十七分，利用夺取的高地和高地上部署的火炮，巴西共和国军队在炮兵配合下，向亚松森守军发动第三次大规模进攻。
炮火轰隆，弹药如雨，在巴西共和国军队的全力进攻下，经历数月战火摧残的亚松森城墙防线仿佛腐朽的老树般，摇摇欲坠。
傍晚十一时零二分，住宅城内的四人摄政委员会和讨逆联军一方爆发第一次大规模冲突，两方高层为了是否坚守亚松森的分歧，大打出手，甚至到了动枪的地步。
